logo

U bent hier

Waarschuwingsbericht

Opgelet! Dit event heeft al plaatsgehad.

Mechanisms of purine and pyrimidinedependent repression of the Escherichia coli carAB operon encoding carbamoylphosphate

donderdag, 14 september, 2006 - 17:00
Campus: Brussels Humanities, Sciences & Engineering campus
Faculteit: Science and Bio-engineering Sciences
D
2.01
Neel Devroede
doctoraatsverdediging

In Eschericha coli zorgt het unieke carbamoylfosfaatsynthase (CPSase, EC 6.3.5.5.) voor de productie van carbamoylfosfaat, precursor voor zowel de arginine- als de pyrimidine- de novo biosynthese. Deze tweevoudige rol wordt weerspiegeld in de complexiteit van de regulatie van CPSase synthese en in de allosterische controle van CPSase activiteit door verschillende effectormoleculen (ornithine, UMP, IMP).

De synthese van CPSase wordt vooral gereguleerd op het niveau van transcriptie-initiatie van het coderende carAB operon. Transcriptie gebeurt vanaf een paar tandempromoters, 67 bp uit elkaar. Transcriptie-initiatie aan de downstream promoter P2 wordt gereguleerd door arginine en de arginine repressor (ArgR). In aanwezigheid van arginine bindt de hexamerische arginine repressor een stel ARG boxen (18 bp imperfect palindroom) die de promoter van de P2 transcriptie overlappen. Repressie van de P2 promoter gebeurt door sterische exclusie van de polymerase binding.

De pyrimidinespecifieke regulatie van de upstream promotor P1 is complex en resulteert uit twee verschillende mechanismen: UTP-sensitieve reïteratieve transcriptie en een belangrijk multi-proteïne afhankelijk transcriptie-initiatie mechanisme. Het laatste heeft de participatie van 3 multifunctionele moleculen nodig: IHF (Integration Host Factor), PepA (Aminopeptidase A) en PyrH (UMP-kinase). Het werd aangetoond dat al deze elementen moeten samenwerken in de opbouw van een specifiek regulatorisch nucleoproteïne complex waarbij IHF en PepA hoofdzakelijk een structurele rol zouden vervullen en PyrH de sensor van de wijzigingen in de nucleotidepool zou zijn. Daarnaast wordt, bij nutritionele stress, de P1 promoter activiteit negatief gereguleerd door de stringent respons.

Deze studie werd toegespitst op volgende zaken: 1- het aantonen en ontrafelen van de purinespecifieke repressie van de P1 promoter, 2- het bepalen van de rol van de linkers, de tussenliggende sequenties die de verschillende bindingssites verbinden, in de pyrimidine- en purine-afhankelijke regulatie van P1, en 3- het bestuderen van de proteïnegeïnduceerde vervorming van het operator-DNA.

In eerste instantie werd aangetoond dat purines de P1 promotoractiviteit inderdaad represseren. Stroomopwaarts van P1 hebben wij een 16 bp stretch gevonden die een hoge gelijkenis vertoont met de PUR box consensus. Het werd aangetoond dat gezuiverd PurR deze potentiële PUR box bindt op een sequentiespecifieke en ligand-afhankelijke manier. Geactiveerd PurR maakt gebruik van de pyrimidinespecifieke nucleoproteïne structuur om zijn effect op carAB transcriptie uit te oefenen en dus zijn de purine- en pyrimidine regulatie van P1 promotoractiviteit zowel functioneel als structureel gekoppeld. PepA speelt hierin een sleutelrol. Deze koppeling tussen purine- en pyrimidine-gemediëerde repressie is uniek en wordt zelfs niet teruggevonden in andere pyrimidine-biosynthese genen waarop purines en PurR ook een controle uitvoeren.

Naast deze onverwachte koppeling tussen de repressie door purines en de pyrimidinespecifieke repressie vertoont de purinespecifieke repressie van P1 in E. coli nog een aantal afwijkende karakteristieken in vergelijking met andere PurR gemediëerde transcriptiecontroles. Allereerst is er de ongewone ligging van de target site van PurR die zeer ongewoon is; 120 bp upstream van de P1 transcriptie-initiatie site. Meestal overlapt de PUR box de promoter ofwel fungeert PurR als een versperring voor een elongerende polymerase, als hij stroomafwaarts bindt. Deze ongewone ligging van de carAB PUR box is hoogstwaarschijnlijk gerelateerd met de structurele en functionele koppeling van de P1 purinespecifieke repressie met de pyrimidinespecifieke regulatie.

Een tweede unieke en uiterst opmerkelijke eigenschap van de carAB PUR box is de guanine op positie 8. In andere PUR boxen vindt men op positie 8 meestal een adenine terug, soms een cytosine of thymine maar nooit een guanine. Vorige studies voorspelden dat een guanine op deze positie zeer ongunstig zou zijn aangezien die een sterische clash zou veroorzaken met de repressor. In vivo en in vitro onderzoek wijst echter uit dat guanine op positie 8 toch een functionele operator geeft, hoewel de binding niet optimaal is. Daarnaast hebben wij ook een model geconstrueerd om aan te tonen hoe de repressor toch met de carAB operator kan binden zonder een sterische clash te veroorzaken.

Bijkomend onderzoek wees erop dat een overmaat purines antagonistische effecten uitoefent op de P1 activiteit: een indirect, stimulerend effect, vermoedelijk afkomstig uit de crosstalk tussen de purine en pyrimidine biosyntheseweg en een directe, PurR-afhankelijke repressie, resulterend in een netto tweevoudige repressie.

De bindingssites van de regulatorische proteïnen, betrokken in de purine- en pyrimidine-specifieke repressie, liggen verspreid over een controlegebied van ongeveer 450 bp, met grote tussenliggende sequenties. Wij hebben onze aandacht gericht op deze linker sequenties en onderzochten het belang van onderlinge afstand en fasering tussen de regulatorische bindingssites door het introduceren van inserties en deleties van verschillende lengte, en combinaties daarvan, in de vier linkers.

De analyse van halve en volledige draai inserties en deleties in verschillende zones van de operator wijst erop dat de pyrimidine-specifieke repressie van P1 activiteit zeer gevoelig is voor perturbaties in de positionering van de verschillende regulatorische bindingssites op het oppervlak van de helix. De systematische analyse van de lengte van linker L2 toont aan dat de afstand tussen de twee PepA boxen, ten opzichte van elkaar en van de promotor, strikt bepaald is voor zowel de pyrimidine- als de purine-specifieke repressie. Gelijkaardig, zijn de afstand en fasering van de IHF en PEPA2 sites strikt beperkt, maar enkel voor de pyrimidinespecifieke repressie. Voor de purinespecifieke repressie is een correcte alignering van deze sites niet vereist, en de IHF bindingssite is zelfs niet onontbeerlijk. Zodus blijkt PepA het sleutelelement te zijn en de correcte ligging van PepA in het regulatorisch nucleoproteïne complex is een absolute vereiste voor zowel de pyrimidine- als de purine-gemediëerde repressie van carAB.

Bij constructen met de combinatie van een insertie en een deletie van gelijke lengte in een enkele linker, liggen alle reeds geïdentificeerde regulatorische bindingssites en de promoter op de correcte positie, enkel de lokale linker sequentie is veranderd. In alle, behalve één, linkers resulteerde deze combinatie in een bijna volledig herstel van de pyrimidinespecifieke repressie, wat er op wijst dat de linker sequentie weinig of geen belang heeft.

L1, naast de promoter gelegen, is de enige linker waarin de combinatie van een 5 bp deletie en een 5 bp insertie (ins3+del8) de pyrimidine-specifieke repressie niet volledig hersteld (3-voudige vermindering). De purinespecifieke repressie was onveranderd. De ins3+del8 operator verschilt van het wilde type op twee posities: een G-C in de plaats van een A- T op positie –60 en A-T naar T-A verandering op positie –57. Deze mutaties bevinden zich in een 17 bp stretch die enkel bestaat uit A en T residu’s. Dit resultaat wijst erop dat dit promoter-proximaal gebied gecontacteerd wordt door een pyrimidine-specifiek component van het regulatorisch complex (mogelijk PyrH, de sensor van het systeem).

De analyse van een P1 mutant (P1-ΔO1), losgekoppeld van de downstream promoter P2 en waarbij het gehele upstream gebied vanaf positie –40 verwijderd werd, toonde aan dat het A+T-rijk gebied upstream van het -35 element niet functioneert als een Upstream Promoter (UP) element.

Tenslotte hebben we de DNA vervormingen, geïnduceerd door het binden van de regulatorische proteïnen, geanalyseerd. We hebben de proteïne-geïnduceerde buiging door PurR, ArgR, IHF en PepA bepaald en toonden aan dat PepA het operator DNA wikkelt. PurR en ArgR induceren een buiging van 97° en 99°, respectievelijk. IHF induceert een bocht van 130°. PepA brengt het grootste effect teweeg: de proteïne wikkelt het DNA met 240° en condenseert meer dan 200 bp in het globulair nucleoproteïne complex. Volume analyse toonde aan dat slechts één PepA hexameer aanwezig is in het PepA-DNA complex, wat betekent dat één enkel hexameer beide PepA boxen bindt. Alle proteïnen geïnduceerde hoeken in het controle gebied van carAB zijn bijna of groter dan 100°. De conformatie van het operator DNA wordt dus uitermate sterk verstoord en vervormd na de binding van deze regulatorische proteïnen. Deze vervormingen zijn essentieel voor de werking van het regulatorisch mechanisme.

Wij hebben een model voorgesteld voor de binding van PepA aan de carAB operator. Beide PepA boxen komen te liggen in een DNA-bindende groeve op de zijde van het PepA hexameer (dimeer van trimeren). Het tussenliggende DNA ligt in een loop over de tussenliggende groeve. Dit DNA en de groeve kunnen echter geen contact maken, aangezien ze in een tegengestelde richting lopen. In deze loop ligt de PUR box, vrij om door PurR gebonden te worden.