logo

U bent hier

Waarschuwingsbericht

Opgelet! Dit event heeft al plaatsgehad.

Molecular analysis of galactose catabolism and exopolysaccharide biosynthesis in Streptococcus thermophilus

maandag, 15 januari, 2007 - 17:00
Campus: Brussels Humanities, Sciences & Engineering campus
Faculteit: Science and Bio-engineering Sciences
D
2.01
Filip De Vin
doctoraatsverdediging

Exopolysacharideproductie door Streptococcus thermophilus
De exopolysachariden (EPS) die geproduceerd worden door melkzuurbacteriën zijn
bijzonder nuttig in gefermenteerde levensmiddelen waarin ze de viscositeit en de
rheologie, de textuur en het mondgevoel beïnvloeden. Bovendien worden aan de door
melkzuurbacteriën geproduceerde EPS gezondheidsbevorderende eigenschappen
toegeschreven zoals de stimulatie van het immuunsysteem en een prebiotisch effect.

Streptococcus thermophilus is een thermofiele melkzuurbacterie die, in co-cultuur met
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, gebruikt wordt voor de productie van
yoghurt. Teneinde de textuur van op grote schaal geproduceerde roeryoghurt te
verbeteren, waterafscheiding te voorkomen en romigere yoghurt te verkrijgen, kunnen
EPS-producerende starterculturen toegepast worden. Daar S. thermophilus slechts
lage hoeveelheden EPS produceert, wordt getracht om de productie op te drijven.
Indien in de toekomst een voldoende grote in situ-productie van EPS gerealiseerd kan
worden, maakt dit het toevoegen van additieven aan yoghurt overbodig.

Deze thesis had tot doel de genclusters betrokken bij het galactosekatabolisme en de
EPS biosynthese in S. thermophilus te bestuderen en genetisch gemodificeerde
S. thermophilus stammen te construeren om de regulatie van de EPS biosynthese te
achterhalen.

Omdat de EPS precursors in lactose fermenterende S. thermophilus stammen gevormd
worden van het galactosedeel van lactose, zou een functionele Leloir afbraakweg
kunnen leiden tot een hogere EPS productie. De meeste S. thermophilus stammen zijn
echter galactose negatief (Gal-). Tot op heden werd het Gal- fenotype uitsluitend
toegeschreven aan een defect in het inductiemechanisme van het snelheidsbepalende
enzym van de Leloir afbraakweg, GalK. Daar het volledig verbruik van galactose een
gewenste eigenschap is in verschillende industriële fermentaties en dus ook tot een
hogere EPS productie zou kunnen leiden, werd het galactose katabolisme uitvoerig
bestudeerd in een groot aantal S. thermophilus stammen. Deze stammencollectie
bevatte acht stammen met een galactose-positieve (Gal+) fenotype sensu stricto en
hiervoor werden de fermentatiekarakteristieken en Leloir enzymactiviteiten bepaald.
Alhoewel GalT en GalE activiteit voor alle Gal+ stammen gemeten kon worden, werd
GalK activiteit enkel gedetecteerd in twee van de acht Gal+ stammen, hetgeen
suggereert dat de andere zes stammen galactose metaboliseren via een alternatieve
route. De galR-galK intergenische regio die de gal promotor bevat, werd voor alle
stammen gesequeneerd en leidde tot acht verschillende nucleotidensequenties.
Sequentieanalyse van deze regio toonde aan dat de gal promotor een belangrijke rol
speelt in het Gal+ fenotype, doch dit niet uitsluitend bepaalt. Bovendien toonde
sequentieanalyse van vier Leloir genclusters aan dat Gal+ stammen, na translatie van
de gal genen, meer verschillen bevatten in aminozuursequentie dan Gal- stammen.

EPS worden gemaakt door polymerisatie van intracellulair gesynthetiseerde
herhalingseenheden. Deze EPS herhalingseenheden worden geassembleerd op een
membraangebonden lipidedrager door opeenvolgende additie van suikerresidu’s
afkomstig van geactiveerde suiker donors (suikernucleotiden) door specifieke
glycosyltransferasen (GTF). Tot op heden zijn er negen verschillende EPS
herhalingseenheden gekend in S. thermophilus maar van enkel drie van deze stammen
is ook de nucleotidensequentie van het eps gencluster beschikbaar. GTF bepalen de
structuur van de EPS herhalingseenheid. Door eps genclusters te sequeneren van
stammen waarvan de EPS herhalingseenheid gekend is, kan de relatie tussen de
aanwezige GTF en de overeenkomstige EPS herhalingseenheid bestudeerd worden. In
dit werk werden vier eps genclusters van S. thermophilus beschreven en vergeleken
met de 23 S. thermophilus eps genclusters van stammen beschikbaar in de GenBank
sequentiedatabank. In silico analyse leverde 15 verschillende types van eps
genclusters op die genen bevatten die coderen voor 70 vermeende GTF waarvan er 54
uniek zijn.

Verschillende genetische constructs werden gemaakt teneinde epsA en epsB, de
regulatorische genen van het eps operon, uit te schakelen en zo de regulatie van de
EPS biosynthese in S. thermophilus te bestuderen. Deze constructs konden echter niet
getransformeerd worden in S. thermophilus. De aanhoudende transformatieproblemen
wijzen erop dat deze stammen zich uiterst moeilijk laten transformeren of dat de
transformatie van deze constructs voor S. thermophilus lethaal is.