logo

U bent hier

Waarschuwingsbericht

Opgelet! Dit event heeft al plaatsgehad.

Kinetic analysis of the purine nucleoside hydrolase mechanism

vrijdag, 14 maart, 2008 - 17:00
Campus: Brussels Humanities, Sciences & Engineering campus
Faculteit: Science and Bio-engineering Sciences
D
2.10
An Vandemeulebroucke
doctoraatsverdediging

Nucleoside hydrolasen katalyseren de hydrolyse van de N-glycosidische binding in nucleoside met vorming van de overeenkomstige base en ribose. Onze onderzoeksgroep heeft afgelopen jaren haar krachten gebundeld om deze enzymen te karakteriseren. In ons labo werd het nucleoside hydrolase van Trypanosoma vivax (TvNH) geanalyseerd als modelsysteem voor de purinespecifieke nucleoside hydrolasen. Deze studie resulteerde in de bepaling van de structuur-functie relatie en het katalytisch mechanisme van dit enzyme (Versées et al., 2001; Versées et al., 2002). Mutagenese studies op dit enzyme toonden echter aan dat het TvNH waarschijnlijk een complex meerstaps reactiemechanisme volgt. Mutagenese van de actieve site residu’s en substraatengineering veroorzaakten nauwelijks een effect op de steady state kinetische parameters, het geen erop wijst dat deze macroscopische parameters een combinatie zijn van verschillende microscopische snelheidsconstanten resulterend in macroscopische parameters die ongevoelig zijn voor wijzigingen van de snelheid van de chemische stap. Dit alles heeft ons ertoe aangezet het TvNH te onderwerpen aan een doorgedreven kinetische analyse van het microscopische reactie mechanisme.

De doorgedreven kinetische analyse toont inderdaad aan dat het enzyme een complex meerstaps mechanisme volgt met een trage productvrijgave als de snelheidsbepalende stap. In deze productvrijgave is een trage isomerisatie van een stabiel enzym·ribose complex naar het snel dissociërend los complex de algemeen snelheidsbepalende stap van de hydrolyse reactie. Verder heeft deze kinetische analyse geleid tot de ontwikkeling van twee mogelijke modellen. Beide modellen zijn gebaseerd op een geordend Uni-Bi kinetisch mechanisme met de vorming van twee enzym·substraatcomplexen en met ribosevrijgave volgend op basevrijgave. Het verschil tussen deze modellen ligt hem in de katalytische capaciteit van de twee enzym·substraatcomplexen. In het “Enkele chemische stap” model is enkel één van de twee complexen katalytisch competent. Het andere complex ondergaat eerst een isomerisatie tot vorming van het katalytisch competent complex alvorens chemie kan plaatsgrijpen. In het “twee chemische stappen” model zijn beide enzym·substraatcomplexen katalytisch competent.

Deze modellen vormden de basis in de bestudering van de contributie van een flexibele loop (loop II) aan de individuele stappen in deze modellen. Proteïne engineering (een proline scan van de loop en loop deletie mutagenese) in combinatie met kinetische analyse (steady state en pre steady state) en structuurbepaling hebben aangetoond dat deze loop een belangrijke rol speelt in leaving group activatie en productvrijgave. Loop II vouwt zich over de actieve site tijdens de reactie. Hierdoor wordt er een water kanaal gevormd dat een rol speelt in leaving group activatie. De loop ordent dit water kanaal wat de protonatie van de N-7 van de leaving group vergemakkelijkt. Eenmaal de chemische stap heeft plaatsgevonden, bepaalt de loop dynamiek de snelheid van productvrijgave. De geordende productvrijgave bestaat uit vier stappen. De dissociatie van elk product wordt voorafgegaan door een trage isomerisatie van de stabiel gebonden enzym·productcomplexen naar snel dissociërende losse complexen. Waarschijnlijk omvat de trage isomerisatie voor base dissociatie een perifere opening van de loop bestaande uit het verwijderen van de actieve site tryptofanen (Trp83 en Trp260) van het base gedeelte en de opening van de loop boven de actieve site. Dit zou omschreven kunnen worden als het openen van een deksel. Ribose zit diep in de actieve site en interageert met zijn 2’OH groep met Asp14. Deze interactie veroorzaakt een omwenteling van de Trp242 zijketen. Dit is beschreven als het trigger mechanisme van de loopordering en vouwing over de actieve site. De relaxatie van het helix gedeelte van de loop II en de verbreking van de interactie met loop I van de andere subunit zou kunnen leiden tot de verbreking van de Asp14-ribose interactie en ribose dissociatie. Bijgevolg omvat ribose vrijgave een “totale” loop opening. Deze “totale” opening vindt veel trage plaats dan de perifere opening vereist voor base vrijgave.

Ten slotte werd nagegaan of de mechanistische principes van het TvNH ook van toepassing zijn voor de andere specificiteitklassen van de NH’s. Hiervoor werden de mechanistische principes vastgesteld tijdens purine hydrolyse gekatalyseerd door TvNH getoetst aan het de hydrolase reactie gekatalyseerd door het IG-specifieke NH van Trypanosoma brucei brucei. Deze kinetische analyse toont aan dat de trage isomerisatie van het stabiel gebonden enzym·ribose complex naar snel dissociërende los complex een geconserveerde stap is in het mechanisme van purine specifieke nucleoside hydrolasen. Vermits de flexibel loop II betrokken in deze isomerisatie bij TvNH geconserveerd is in de nucleoside hydrolase familie, is het mogelijk dat deze loop een functioneel element vormt in het katalytisch mechanisme van de nucleoside hydrolase familie.