De sequentiebepaling van DNA geeft inzicht in de blauwdruk van levende cellen en wordt gebruikt in vele aspecten van biologische wetenschappen, geneeskunde, biotechnologie en forensische wetenschappen. Een ultrasnelle manier om DNA te lezen is door de ‘letters’ van afzonderlijke DNA strengen te lezen terwijl ze door een nanoporie gaan. Een nieuwe studie door het team van Prof. Han Remaut (VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie) en Oxford Nanopore Technologies presenteert een nanoporie die is ontworpen om twee vernauwingen of ‘constricties’ te bevatten. Dergelijke nanoporiën met dubbele constrictie blijken voordelig te zijn bij het uitlezen van gebieden van DNA die moeilijker te analyseren zijn door conventionele nanoporiën. Hun werk verschijnt in Nature Biotechnology.
DNA-sequentiebepaling in de moderne geneeskunde
De sequentie van ons DNA bevat een schat aan informatie. Het is een moleculaire identiteitskaart die de informatie bevat over de werking van onze cellen. De sequentiebepaling van delen of het geheel van ons DNA (ons genoom) kan ons bijvoorbeeld informeren over het risico op erfelijke ziekten, of de aanwezigheid en progressie van kanker.
Ook kan het bepalen van de sequentie van DNA of RNA dat aanwezig is in ons speeksel of onze ontlasting de aanwezigheid van ziektekiemen zoals bacteriën en virussen identificeren en voorspellen hoe deze zullen reageren op antibiotische therapie.
Het is niet verrassend dat DNA sequentiebepaling een steeds belangrijkere rol speelt in de moderne geneeskunde en er wordt dan ook veel moeite gedaan om het lezen van ons DNA snel en kostenefficiënt te maken
Nanoporiën
In 2014 bracht het Britse bedrijf Oxford Nanopore Technologies een krachtige nieuwe manier uit om DNA te lezen: nanopore sequencing, initieel in een zakformaat toestelletje, de MinION. Bij deze techniek worden DNA-strengen door een nanoporie (een minuscuul ‘eiwitkanaaltje’) geleid dat zich in een elektrisch veld bevindt. Het passeren van de verschillende nucleotiden (DNA ‘letters’) verandert de elektrische stroom die wordt opgewekt door ionen die door de nanoporie stromen.
Op deze manier kan DNA worden 'gelezen' met honderden letters per seconde in kleine hightech apparaten die in de palm van je hand passen – alsook in grotere toestellen die meerdere humane genomen simultaan kunnen lezen. Sommige DNA gebieden zijn echter moeilijker af te lezen door de beschikbare nanoporiën. Dit geldt met name voor homopolymere gebieden, stukken DNA waar dezelfde letter wordt herhaald.
De huidige sequencing chips (“R9” serie) van Oxford Nanopore gebruiken een nanoporie die een aangepaste versie is van CsgG, een eiwit dat is geleend van bacteriën. Bacteriën gebruiken CsgG kanalen om andere eiwitten naar het celoppervlak te transporteren. Door een uitgebreide reeks aanpassingen werd het CsgG-kanaal omgevormd tot een nanoporie met optimale eigenschappen voor DNA sequentiebepaling. Het lab van Han Remaut bestudeert de biologische rol van CsgG kanalen in bacteriën.
Eerste auteur van de studie Sander Van der Verren zegt: "Met behulp van elektronen cryo-microscopie bestudeerde ik hoe CsgG samenwerkt met een partnereiwit genaamd CsgF, en ontdekte dat CsgF gedeeltelijk bindt in het CsgG kanaal om zo een tweede vernauwing te maken."
Een dubbele lezer
Bij nanoporie sequentiebepaling heeft de porievernauwing een bepalende bijdrage aan de elektrische signalen die het mogelijk maken passerende moleculen zoals DNA te lezen. De onderzoekers redeneerden dat het voordelig kan zijn om twee opeenvolgende vernauwingen te hebben om moeilijk leesbare DNA-gebieden te lezen.
In samenwerking met het nanoporie team onder leiding van Dr. Lakmal Jayasinghe van Oxford Nanopore, toonden de onderzoekers aan dat een fragment van CsgF ook een dubbele vernauwing kan introduceren in de aangepaste CsgG nanoporiën die worden gebruikt voor DNA-sequentiebepaling. Bij het gebruik van deze prototype nanoporiën met dubbele vernauwing ontdekten de teams dat de aanwezigheid van een tweede vernauwing het gemakkelijker maakt om het aantal letters in homopolymere gebieden van het DNA te ontcijferen.
Een dubbel constrictie nanoporie die gebruikt wordt in R10 sequencing chips van Oxford Nanopore toont veelbelovende resultaten in het lezen van homopolymeer gebeiden, en maakt het zo mogelijk om met een hoge nauwkeurigheid enkelvoudige DNA strengen te lezen en een consensus accuraatheid van 99.999% te behalen op kleine genomen. Deze bemoedigende resultaten openen de weg naar verdere aanpassingen van deze biologische eiwitkanaaltjes tot een instrument dat toelaat om DNA te lezen met de hoogst mogelijke precisie, met een minimale hoeveelheid materiaal en in een mum van tijd.
Han Remaut: "Bij VIB bestuderen we continu hoe fundamentele biologische processen nieuwe manieren kunnen inspireren om krachtige technologische hulpmiddelen te ontwikkelen die medische en maatschappelijke problemen helpen op te lossen."
---
Nota:
Oxford Nanopore Technologies onthult niet het precieze ontwerp van de nanoporiën die in hun apparaten worden gebruikt; over de jaren hebben ze duizenden ontwerpen van nanoporiën gemaakt en getest, waarvan er vele grote structurele overeenkomsten tonen, maar genuanceerde verschillen hebben die de prestaties kunnen optimaliseren.
Er zijn momenteel sequencing chips met twee verschillende soorten poriën beschikbaar: R9.4.1 en R10.3; ONT heeft gesproken over het feit dat R10 een nanoporie met een dubbel constrictie concept gebruikt, samen met specifieke analysemethoden, om een verbeterde analyse van bepaalde regio's te ondersteunen, bijvoorbeeld langere homopolymere herhalingen. Voor de meest actuele prestatie-informatie over beide poriën kunt u terecht op www.nanoporetech.com/accuracy
Publication:
Sander E. Van der Verren, Nani Van Gerven, Wim Jonckheere, Richard Hambley, Pratik Singh, John Kilgour, Michael Jordan, E. Jayne Wallace, Lakmal Jayasinghe and Han Remaut (2020). A dual-constriction biological nanopore resolves homonucleotide sequences with high fidelity. Nature Biotechnology. Doi: 10.1038/s41587-020-0570-8
Financiering:
FWO via een PhD aspirant beurs aan Sander Van der Verren. EC Horizon 2020 vie de ERC consolidator grant ‘BAS-SBBT’, grant agreement no. 649082